COMENTÁRIO

Metagenômica: futuro do diagnóstico molecular das neuroinfecções?

Dr. Renan Domingues

Notificação

13 de dezembro de 2021

Colaboração Editorial

Medscape &

Os testes de detecção de DNA ou RNA de organismos infecciosos (p. ex., bactérias, vírus) têm impactado enormemente o diagnóstico e o manejo de doenças infecciosas. Isso é particularmente verdadeiro para infecções do sistema nervoso central (SNC), onde a identificação rápida e precisa do patógeno, bem como o início imediato da terapia antimicrobiana, são cruciais. A crescente disponibilidade dos testes moleculares para a detecção de microrganismos no líquido cefalorraquidiano (LCR) redefiniu a abordagem para infecções comuns do SNC, como as meningites e as encefalites (Domingues, 2012; Young and Thomas, 2018).

Princípios gerais do diagnóstico molecular em LCR

Os métodos moleculares são particularmente adequados para o diagnóstico das infecções do SNC, pois elas são, em geral, monomicrobianas (com exceção do abscesso cerebral bacteriano). Além disso, o LCR normalmente não contém inibidores comuns de métodos de amplificação de ácido nucleico (p. ex., a reação em cadeia da polimerase — PCR), que são inibidos por heme, endonucleases e exonucleases, que podem levar a resultados falso-negativos, e que estão ausentes no LCR. Como resultado, a detecção molecular no LCR é menos propensa a resultados falso-positivos (p. ex., por contaminação ou presença de colonização não patogênica) ou falso-negativos (por inibição da amplificação), em comparação com outros fluidos (Kleinschmidt-DeMasters et al., 2001; Debiasi et al., 2004).

Os testes moleculares podem ser classificados em:

  • Testes direcionados: têm como alvo uma região específica do genoma de um determinado microrganismo. São geralmente mais sensíveis do que os métodos convencionais de detecção de antígeno ou cultura, e podem detectar organismos que não são cultiváveis. Em algumas infecções, como a encefalite pelo VHS (herpes simples) e a leucoencefalopatia multifocal progressiva (LEMP) pelo vírus JC, a sensibilidade clínica é bem conhecida, e foi comparada com o padrão de referência (p. ex., biópsia cerebral) (Weber et al., 1997; Domingues et al., 1997).

  • Testes multiplex: Os testes de amplificação de ácido nucleico multiplex ou baseados em painéis combinam várias detecções individuais em um único teste, permitindo a testagem simultânea de uma série de patógenos suspeitos de causar uma síndrome clínica. Alguns exemplos são painéis virais, bacterianos etc. Em 2015, o uso do primeiro teste multiplex comercial para causas infecciosas de meningite e encefalite comunitárias foi autorizado pela Food and Drug Administration (FDA) para o auxílio no diagnóstico dessas doenças. Este teste multiplex, o Biofire FilmArray, detecta 14 patógenos bacterianos, virais e fúngicos, em pouco mais de uma hora, incluindo: Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus agalactiae (ou seja, Streptococcus do grupo B), Escherichia coli (sorotipo K1), Listeria monocytogenes, enterovírus, VHS-1, VHS-2, vírus varicela-zóster (VVZ), citomegalovírus (CMV), herpesvírus humano tipo 6 (HVH-6)[1], parecovírus humano e Cryptococcus neoformans/gattii. Uma metanálise de oito estudos de precisão diagnóstica, avaliando o BioFire FilmArray, demonstrou alta sensibilidade e especificidade (respectivamente, de 90% (IC 95% de 86 a 93%) e 97% (IC 95% de 94 a 99%), respectivamente (Tansarli et al., 2020; Domingues et al., 2019; Domingues et al., 2021).

Metagenômica

A metagenônica, ou mais precisamente o sequenciamento metagenômico de nova geração (NGS), é uma tecnologia molecular em rápida evolução que tem o potencial de fornecer uma análise direta e imparcial da composição microbiana de amostras clínicas, sem depender de cultura tradicional ou de testes moleculares direcionados.

O NGS consiste na análise abrangente do material genético microbiano (DNA ou RNA), em amostras de pacientes. Usa as técnicas de metagenômica para a identificação e caracterização genômica de bactérias, fungos, parasitas e vírus, sem a necessidade de um conhecimento prévio de um patógeno específico nas amostras clínicas.

No NGS, todo o DNA e/ou RNA é sequenciado usando primers (sondas genéticas) universais. As leituras de todos os sequenciamentos gerados pelo NGS são montadas em genomas parciais ou completos, gerando identificação de potenciais patógenos presentes na amostra. A capacidade de detectar todos os patógenos potenciais em uma amostra torna o NGS uma ferramenta potente no diagnóstico de doenças infecciosas, especialmente quando outros ensaios mais direcionados, como o PCR, falham. Ainda há limitações que incluem ausência de validação clínica, pouco conhecimento acerca da sensibilidade, custo e considerações regulatórias (Edrige et al., 2019).

As etapas na realização do NGS no LCR incluem:

  • coleta cuidadosa, pois a contaminação com sangue (acidente de punção) pode interferir no resultado;

  • extração de RNA / DNA;

  • estratégias de otimização, reduzindo o sinal (ruído de fundo) no sequenciamento metagenômico oriundo de outros genomas que não dos patógenos, usando DNases e RNases;

  • sequenciamento de alto rendimento: todos os fragmentos de ácidos nucleicos da biblioteca são sequenciados, aumentando as chances de detecção. Para isso, usam-se plataformas específicas; e

  • análise bioinformática: a análise e interpretação dos dados que se seguem à amplificação requerem conhecimento especializado em bioinformática e recursos computacionais apropriados. Os dados brutos de uma plataforma de sequenciamento são apurados e filtrados para remover leituras duplicadas e de baixa qualidade. A remoção das leituras do genoma/transcriptoma do hospedeiro é realizada para diminuir o ruído de fundo (p. ex., leituras do hospedeiro e ambientais) e aumentar a frequência das leituras do patógeno. A identificação taxonômica subsequente é realizada combinando-se os genomas e sequências em bancos de dados de nucleotídeos e proteínas. Alguns softwares foram especificamente desenvolvidos com esta finalidade (Gu et al., 2019).

Alguns estudos têm avaliado a utilidade clínica do NGS no LCR para o diagnóstico de neuroinfecção. Em um estudo prospectivo de 204 pacientes com meningite, encefalite ou mielite, que não tinham um diagnóstico no momento da admissão, o agente etiológico foi identificado apenas por testes convencionais em 45% dos pacientes, por NGS isolado em 22%, e por ambos os métodos em 33% dos casos. O uso prévio de antibióticos pode ter comprometido os resultados da cultura do LCR, mas não o do NGS (Wilson et al., 2019).

Outro estudo avaliou a precisão do NGS em 95 amostras de pacientes, revelando 73% de sensibilidade e 99% de especificidade, em comparação com os resultados do teste clínico original. Neste mesmo estudo, foram avaliadas 20 amostras de LCR, coletadas prospectivamente de uma coorte de crianças internadas com meningite, encefalite e/ou mielite, mostrando sensibilidade de 92% e especificidade de 96% em relação ao teste microbiológico convencional na identificação do agente etiológico (Miller et al., 2019).

Zhang et al. conduziram um estudo de coorte prospectivo, comparando o NGS com os métodos convencionais, incluindo cultura, em 248 pacientes com suspeita de infecção do SNC. O NGS relatou uma sensibilidade de 90% (9/10) em pacientes com cultura positiva sem tratamento empírico e 66,67% (6/9) em pacientes tratados empiricamente. Em comparação com os métodos convencionais, a concordância percentual positiva e concordância percentual negativa foi de 75% e 69%, respectivamente.

Portanto, o NGS tem mostrado um desempenho diagnóstico satisfatório e promissor em infecções do SNC, com uma taxa de detecção geral superior à cultura. O NGS pode apresentar vantagens diagnósticas, especialmente em pacientes previamente tratados empiricamente com antimicrobianos. O NGS pode também monitorar dinamicamente a progressão da doença. Apesar disso, o NGS tem aplicabilidade em contextos clínicos selecionados, mas seu uso rotineiro ainda não é indicado. Estudos adicionais são necessários para definir claramente os critérios clínicos e laboratoriais que otimizarão o valor do NGS no LCR no diagnóstico das neuroinfecções.

Considerações finais

Os testes de diagnóstico molecular tiveram um impacto dramático tanto no diagnóstico quanto no manejo de infecções do SNC, onde a identificação rápida e precisa de um patógeno e o início imediato da terapia antimicrobiana são fundamentais.

Os métodos moleculares são particularmente adequados para o diagnóstico de infecções do SNC, porque as amostras do SNC são menos propensas a resultados falso-positivos ou falso-negativos.

Os métodos de detecção de ácido nucleico são geralmente mais sensíveis do que os métodos convencionais de detecção de antígeno ou cultura.

A metagenômica é uma tecnologia que apresenta a vantagem de uma busca ampla por agentes infecciosos, sem necessidade de direcionamento prévio.

A metagenômica poderá, futuramente, substituir os métodos convencionais de cultura e os métodos moleculares convencionais. Contudo, os estudos realizados ainda não permitem seu uso clínico rotineiro, sendo necessário estudos prospectivos, avaliando a sensibilidade e especificidade desta técnica nas diferentes infecções do sistema nervoso.

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